yueban-1147 (2014-3-21 16:15:30)
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原帖由 vvmmoy 于 2014-3-21 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
最近要做western blot实验，好多是一头雾水，要靠自己摸，还是好多问题不明白向大家请教：
1 要做组织提取的蛋白，我分实验组和对照组，每组应该取多少个标本做？
2 组织经裂解和匀浆后收取上清，直接-20度保存还是-80度保存好，要不 ... 1.每组样本≥3就可以了;
2.提取的组织样本离心后, 要放在-80度保存;
3.可以等组织标本一起收集后再测蛋白浓度,但已收集到的样本要放在-80度保存;
4.测蛋白浓度有多种方法, 可以根据自己的情况选择;
5.蛋白浓度测定后, 要将样本用去离子水或裂解液调成统一浓度,再加入loading buffer, 100度5分钟后分装, 放在-20度保存即可.
Good luck!
vvmmoy (2014-3-21 16:15:53)
还有个问题，调成统一浓度后，加入loading buffer,loading buffer 里有DTT，那我100度5分钟后分装，放－20度保存可以保存多久呢？是不是大概只有一周到两周呢？
vvmmoy (2014-3-21 16:16:36)
我查到的上样缓冲液配法大多是
50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0）2.5ml
DTT 0.39g
SDS 0.5g
溴酚蓝 0..025
甘油 2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管，我打算用这个loading buffer，里面含有DTT。
浓度测定后可以直接用这个调成一致浓度吗？
yueban-1147 (2014-3-21 16:17:36)
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原帖由 vvmmoy 于 2014-3-21 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
还有个问题，调成统一浓度后，加入loading buffer,loading buffer 里有DTT，那我100度5分钟后分装，放－20度保存可以保存多久呢？是不是大概只有一周到两周呢？ ... 100度5分钟煮沸后, 放－20度可以保存几个月至半年, 蛋白一般不会降解.
yueban-1147 (2014-3-21 16:18:01)
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原帖由 vvmmoy 于 2014-3-21 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
我查到的上样缓冲液配法大多是
50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0）2.5ml
DTT 0.39g
SDS 0.5g
溴酚蓝 0..025
甘油 2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管，我打算用这个loading buffer，里面含有DTT。
浓度测定后可以直接用这个调成一致 ... 测定蛋白浓度后,要用去离子水或裂解液调成统一的浓度,然后再加入loading buffer煮沸, 我们实验室配成5乘loading buffer
50 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)
100 mm/L DTT
2% SDS
0.1% 溴芬兰
10% 甘油
1ml 分装后贮存于-20度
按样品:loading buffer为4:1的比例加loading buffer,再煮沸.
utt0989 (2014-3-21 16:18:20)
我觉得不用放在-20吧,因为每次都用的少这样会反复冻溶,反而不方便了,放在4度就可以了
vvmmoy (2014-3-21 16:18:44)
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原帖由 utt0989 于 2014-3-21 16:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
我觉得不用放在-20吧,因为每次都用的少这样会反复冻溶,反而不方便了,放在4度就可以了
如果放在4度你不能长期保存,我问过做的同学,说是如果细胞提取的放-20度最好一周内做掉,不要放那么久,因为我也是新手,所以还没有经验.不知道是不是真的.
8princess8 (2014-3-21 16:19:30)
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原帖由 vvmmoy 于 2014-3-21 16:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
如果放在4度你不能长期保存,我问过做的同学,说是如果细胞提取的放-20度最好一周内做掉,不要放那么久,因为我也是新手,所以还没有经验.不知道是不是真的. ... 变性过的蛋白啊,没多大影响吧.